(Merck)
Di- sodium hydrogen phosphate (Merck)
غذای مخصوص موش
گیمسا
3-2- وسایل و دستگاه ها
سمپلر 10-1 میکرولیتری
سمپلر100-10 میکرولیتری
سمپلر 1000-100 میکرولیتری
ترازو
قفس وظرف آبخوری موش
سرنگ انسولینی
جعبه open field
استوانه مخصوص آزمون شنا
دستگاه ماز بعلاوه مرتفع
دماسنج
هیتر
لام و لامل بلند
وسایل تشریح
ست پرفیوژن
3-3- روش انجام کار
موشهای صحرایی سفید آزمایشگاهی(Rat) از نژاد ویستار با وزن 180 تا 220 گرم از مؤسسه سرم سازی رازی تهیه شده و در اتاق حیوانات بخش زیستشناسی با دمای 2±22 درجه سانتیگراد و سیکل 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آب و غذا به میزان کافی در اختیار موشها قرار داشت. برای جفتگیری دو موش صحرائی ماده جوان با یک موش صحرائی نر در یک قفس قرار میگرفت. به منظور اطمینان از باردار بودن مادهها هر روز تست اسمیر از واژن موش گرفته میشد. جهت تست اسمیر از موش مادهای که برای جفتگیری در کنار موش نر قرار گرفته بود بوسیله قطره چکان نمونه واژینال تهیه و به لام حاوی یک قطره آب منتقل میشد. بعد از خشک شدن نمونه، برای فیکس شدن نمونه، روی آن الکل ریخته و صبر میکنیم تا خشک شود. و بعد روی نمونه گیمسا ریخته و 20 دقیقه رنگ گیمسا را روی نمونه نگه میداریم تا کاملا رنگ بگیرد و بعد رنگ را شسته و نمونه را زیر میکروسکوپ مشاهده میکنیم. در صورت مشاهده اسپرم، حاملگی تأیید میشد. پس از بررسی میکروسکوپی و در صورت تشخیص حامله بودن، موش حامله از بقیه جدا شده و در قفس مجزا نگهداری
میشد. این روز به عنوان روز صفر حاملگی در نظر گرفته میشد.
روز 15 بارداری، موشهای صحرایی ماده وزن شده و به صورت کاملاً تصادفی برای تیمار در یکی از گروههای مورد مطالعه انتخاب میشدند. موشهای صحرایی ماده حامله به سه گروه تقسیم شدند. مادران گروه کنترل در کل دوران حاملگی و شیردهی آب معمولی دریافت
میکردند. گروه شاهد از شروع روز پانزدهم حاملگی تا پایان روز هفت بعد از زایمان میزان 40 میلیگرم بر کیلوگرم ساخارین در روز به صورت محلول در آب معمولی دریافت میکردند. گروه آزمایش از روز پانزدهم حاملگی تا پایان روز هفت بعد از زایمان میزان 20 میلیگرم بر کیلوگرم در روز داروی اتوسوکسیماید به همراه 40 میلیگرم بر کیلوگرم ساخارین در روز را به صورت محلول با آب دریافت میکردند. از شروع روز پانزدهم مادران باردار گروه شاهد و آزمایش با احتیاط کامل به صورت یک روز در میان وزن میشدند. و میزان محلولی را که طی یک شبانه روز بایستی دریافت کنند تعیین کرده و در طی روز میزان محلول مصرفی به صورت متناوب به وسیله استوانه مدرج برحسب میلیلیتر سنجیده شده پس از دریافت میزان مناسب، در ادامه روز آب معمولی در اختیار مادران قرار میگرفت. تقریبا 21 روز بعد از شروع بارداری، موش صحرایی حامله زایمان میکند که روز اول زایمان را روز صفر تولد در نظرگرفته و فردای آن، به عنوان روز اول پس از تولد ثبت میشد. در روز اول پس از تولد در صورتی که تعداد نوزادان بیش از 8 سر بود تعداد 8 سر به صورت تصادفی انتخاب شده و بقیه پس از بیهوشی عمیق قربانی میشدند. مادر و نوزادها به طور یک روز درمیان وزن میشدند تا میزان محلول ساخارین و اتوسوکسیماید- ساخارین دریافتی تا روز 7 بعد از تولد مشخص شود.
در روز 9 پس از تولد از بین نوزادان هر مادر یک نر و یک ماده جهت پرفیوژن ترنسکاردیال و مطالعه مرگ نورونی آپاپتوتیک در هسته سجافی پشتی استفاد میشدند. نوزادان باقی مانده در روز 25 پس از تولد از مادر جدا میشدند و در روز 40 پس از تولد زادههای نر و ماده از هم تفکیک میشدند. از روز 60 بعد از تولد آزمون اضطراب در ماز بعلاوه مرتفع و شنای اجباری بر روی موشهای صحرایی انجام میشد.
شکل 3-1- تست اسمیر (اسپرمهای موش صحرایی)
3-4- آزمون حرکتی Open field
قبل از آزمون رفتاری، موشهای صحرایی وزن شدند و برای اطمینان از صحت فعالیت حرکتی موشهای صحرایی آزمون Open field انجام گرفت.
آزمون Open field یک آزمون حسی- حرکتی ساده33 است که فعالیت پایه حیوانی34 و تکامل آن در پاسخ به محیط جدید یا محیط اضطرابزا و درمان دارویی و ضایعه یا اصلاح ژنتیکی را مورد ارزیابی قرار میدهد (Denenberg, 1969).
جعبه Open field به شکل مکعبی با ابعاد40×40×40 است. کف آن با دو خط متقاطع به 4 قسمت برابر تقسیم شده است. تعداد دفعاتی که یک موش صحرایی در مدت 300 ثانیه از این خطوط عبور میکند به عنوان شاخصی از فعالیت حرکتی موش صحرایی در نظر گرفته میشود.
شکل 3-2- دستگاه تست فعالیت حرکتی
3-5- ماز بعلاوه مرتفع 35
دستگاه ماز بعلاوه مرتفع دستگاهی است به شکل بعلاوه، با دو بازوی باز و دو بازوی بسته که در ارتفاع 70-40 سانتیمتری از سطح زمین قرار گرفته است. آزمون ماز بعلاوه یک آزمون نسبتاً جدید برای شناسایی سطح اضطراب و نیز تأثیر داروهای اضطرابزا و ضد اضطراب در موش صحرایی است. بطور طبیعی موش ها ورود کمتری به بازوهای باز، نسبت به بازوهای بسته دارند و در نتیجه به نسبت، زمان کوتاهی را در بازوهای باز میگذرانند. کاهش ماندن در بازوهای باز به نسبت ماندن در بازوهای بسته، بیشترین ارتباط را با رفتارهای اضطرابی و غلظتهای بالای کورتیکواسترون پلاسمای موش دارد (Hogg, 1996).
شکل 3-3- دستگاه ماز بعلاوه مرتفع
3-6- آزمون شنای اجباری36
این تست بر اساس فرار از محرک آزار دهنده پایهگذاری شده است و غالباً برای اندازه گیری اثر داروهای ضدافسردگی مورد استفاده قرار میگیرد. در این روش موش در یک استوانه شفاف پر شده از آب با درجه حرارت بین ?30-24 قرار میگیرد، به صورتی که نمیتواند فرار کند. ارتفاع استوانه 30 سانتیمتر و قطر آن 20 سانتیمتر است. عمق آب باید به اندازهای باشد که حیوان نتواند کف استوانه را با پا یا دم خود لمس کند موش در ابتدا برای فرار از این وضعیت تلاش میکند، اما بعد از مدتی بیحرکت میشود. که این عدم تحرک به صورت شناور ماندن به حالت غیرفعال و یا فقط ایجاد حرکات لازم برای شناور ماندن مشخص میشود و شاخصی از میزان افسردگی است. رفتار موش در مدت زمان تلاش برای یافتن راهی برای خروج و نیز مدت زمان عدم تحرک ثبت و محاسبه میشود. این تست در دو جلسه انجام میشد، به صورتی که در روز اول موش به مدت 15 دقیقه درون استوانه قرار میگرفت و رفتار موش در 5 دقیقه اول ثبت میشد. 15 دقیقه بعد از اتمام جلسه اول به موش داروی فلوکستین با غلظت mg/kg10 به صورت داخل صفاقی تزریق میشد. به همین ترتیب، موش 20 و 23 ساعت بعد از آغاز جلسه اول این غلظت از فلوکستین را دریافت میکرد. جلسه دوم آزمون شنای اجباری به مدت 5 دقیقه انجام و ثبت میگردید. نتایج حاصل از این آزمایش به این صورت تفسیر میشود که زیاد بودن مدت زمان عدم تحرک، یک رفتار مرتبط با روحیه منفی و نوعی ناامیدی (افسردگی) در موش است.
شکل 3-4- آزمون شنای اجباری
3-7- آمادهسازی محلولهای پرفیوژن
برای تهیه بافر فسفات 2/0 مولار، 56/1 گرم فسفات سدیم مونوبازیک و 07/7 گرم از فسفات سدیم دی بازیک را در 200 میلیلیتر آب مقطر حل میکنیم، سپس حجم محلول را به 250 میلیلیتر میرسانیم.
برای تهیه پارافرمالدئید 8%، 12 گرم پارافرمالدئید به 150 میلیلیتر آب مقطر اضافه کرده و ضمن مخلوط کردن تا دمای 67 درجه سانتیگراد حرارت میدهیم. سپس به آهستگی یک قطره محلول سود 1 نرمال اضافه میکنیم تا محلول بیرنگ شود. سپس محلول را از کاغذ صافی عبور داده و پس از سرد شدن در ظرف در بسته و در یخچال نگهداری میکنیم. به منظور آمادهسازی پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار، حجمهای مساوی از بافر فسفات 2/0 مولار و پارافرمالدئید 8% را به هم میافزائیم.
3-7-1- پرفیوژن و خارج کردن مغز از جمجمه
در روز نهم بعد از تولد، موش ها با دی اتیل اتر بیهوش میشدند. سپس حیوان در تشتک جراحی قرار میگرفت و دست و پای حیوان ثابت میشد. بعد ناحیه قفسه سینه باز شده و به وسیله ست سرم و از طریق آئورت با محلول سالین 9/0 درصد و متعاقباً با محلول سرد پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار پرفیوژ میشد. پس از اتمام پرفیوژن جمجمه به مدت 1 شب در پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار نگهداری شد. روز بعد مغز از جمجمه خارج میشد.
شکل 3-5- پرفیوژن
3-7-2- برش گیری
پس از بیرون آوردن مغز از جمجمه، مغز به مدت 24 ساعت در محلول پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار قرار داده میشد تا کاملاً بافت آن فیکس شود. سپس بلوکی شامل ساقه مغز برای تهیه برشهایی کرونال به ضخامت 80 میکرومتر در دستگاه ویبرواسلایس قرار داده شد. تیغههای استفاده شده در این دستگاه از جنس استیل ضد زنگ بود. سرعت حرکت تیغه و فرکانس لرزش آن قابل تنظیم است. از هر 4-3 برش تهیه شده یکی برای واکنش ایمونوهیستوشیمی انتخاب شده و 3 بار با محلول بافر فسفات 1/0 مولار شتستشو میشدند.
3-7-3- ایمونوهیستوشیمی
برای حذف فعالیت پرکسیدازی اندوژن، برشهای شسته شده به مدت 35 دقیقه در محلول هیدروژن پراکسید 3 درصد در بافر فسفات 1/0 مولار قرار گرفتند و پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات (پنج دقیقه) 1/0 مولار به مدت یک ساعت در محلول blocking که شامل بافر فسفات 1/0 مولار، Triton X-100 3/0 درصد و سرم آلبومین گاوی37 1/0 درصد بود، منتقل شدند. سپس برشها به مدت 72 ساعت در محلول حاوی آنتیبادی کاسپاز 3 در بافر فسفات 1/0 مولار حاوی سرم آلبومین گاوی 1/0 درصد و Triton X-100 3/0 درصد قرار میگرفتند. پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات (دو دقیقه) برشها به مدت 12 ساعت در محلول حاوی آنتیبادی ثانویه در بافر فسفات 1/0 مولار حاوی سرم آلبومین گاوی 1/0 درصد و Triton X-100 3/0 درصد قرار داده شدند. برشها بعد از خروج از محلول حاوی آنتی بادی ثانویه یکبار با بافر فسفات 1/0 مولار به مدت دو دقیقه شستشو داده میشدند. در آخرین مرحله محصول واکنش در حضور دی آمینوبنزیدین38 با غلظت 1 میلیگرم بر میلیلیتر و هیدروژن پراکسید 02/0 درصد در بافر Tris-Hcl 05/0 مولار با 2/7PH= قابل مشاهده گردید و برشها پس از 2 بار شستشو با بافر فسفات 1/0 مولار (دو دقیقه) به لام ژلاتینی منتقل شدند. بعد از انتقال برشها روی لام ژلاتینی شده، آنها را در رک چیده و پس از خشک شدن به مدت 10 ثانیه در جار حاوی الکل 70 درصد در اسید استیک، 10 ثانیه در الکل 97 درصد، 10 ثانیه در الکل مطلق، 5 دقیقه در زایلول 1 و 5 دقیقه در زایلول 2 قرار داده شدند. سپس روی لام چند قطره چسب انتلان ریخته و لامل به آهستگی روی لام قرار داده شد.

مطلب مشابه :  منابع پایان نامه درموردمصرف کنندگان، بهره بردار
دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید